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蛋白质晶体结构与药物发现(5)

蛋白质晶体结构与药物发现(5)

蛋白质晶体数据的收集:

蛋白质晶体平均含有50%的溶剂,如果暴露于空气中,它们会干燥并分解。此外,当在室温下暴露于高强度X射线时,由于辐射损伤,它们会非常快速地失去衍射能力。为了延长晶体使用寿命和?#32435;?#25968;据质量,X射线测量现在通常在80-110 K下进行。晶体首先安装在10-20微米尼龙环上,然后浸入液氮中快速冷冻。为了防止形成冰晶,通常有必要向周围的母液中加入冷冻保护剂如?#35270;停?#20302;分子量聚乙二醇或高盐。

为了收集数据,首先将将晶体置于角度计上,该仪器控制X射线束下的晶体旋转,于此同时向晶体吹干燥氮气使?#38706;?#20445;持在80-110K(如上图所示)。对衍射效果较好的晶体可以使用旋转阳极X射线发生器测量,但对于衍射效果不好的晶体,需要使用同步辐射源,例如瑞士的Swiss Light Source(SLS)或法国的同步辐射装置(ESRF)等。在数据收集过程中,晶体慢慢旋转,使所有反射面都进入衍射状态。

衍射斑点通常记录在CCD检测器或基于?#19978;?#26495;的检测器上。对高质量晶体而言,收集高质量X射线数据集的时间只需要几分钟。而对于弱衍射晶体,从高强度同步辐射源下,收集高质量的数据需要几天到几周的时间。探测器的衍射图像(如下图所示)直接输入计算机,产生一系列反射强度。每个晶体将会记录数千到数十万个反射,这取决于晶体的质量和晶胞的大小。

X射线对晶体的衍射:

光学显微镜和X射线晶体学具有相同的基本原理。光学显微镜使我们能够详细研究昆虫或细胞切片等小样本,但物理上不可能发现任何小于所用光波长?#35805;?#30340;微小物质。为了解析大约1-5?(0.1-0.5 nm)的细小原子结构,需要比波长更短的电磁波例如X射线。光学显微镜和X射线装置具有相同的基本原理,但由于X射线和可见光的不同性质,实际实施方?#25509;?#24456;大不同。

在光学显微镜中,光线照射在样品上,并散射到各个方向。使用一组透镜重组散射光重建原始样本的放大图像。在X射线实验中,来自X射线源的X射线击中了晶体,并在各个方向上散射,就像光学显微镜一样。遗憾的是,不能制造能够将散射的X射线聚焦以重建样本的放大图像的透镜。 所有晶体学家可以做的就是直接记录散射的X射线,并使用计算机程序重建样品的放大图像。

晶体结构中出现?#29616;?#38169;误是非常罕见?#27169;?#36890;常?#29616;?#38169;误出现在新靶标结构的首次测定中,尤其是在只有低分辨率数据(3.0-5.0?)可用时。但是,晶体结构中的小错误和结构的不准确性是非常普遍?#27169;?#32780;且几乎是不可避免的。这些晶体结构中错误的往往被忽视,晶体结构的小细节往往被非晶体学家过度解释。所以晶体结构的使用者应?#20204;?#26970;晶体结构的局限性。

影响蛋白质模型的因素:

大分子结晶学中的一个主要误差来源是,由于分辨?#35270;?#38480;且观察比率?#38382;?#19981;合适,因此我们无法?#23454;?#22320;检测和模拟“无序”。模型的建模过程通常试图将源自几个不同但重叠的构象状态的模糊电?#29992;?#24230;图模拟成单个模型。这可能导?#24405;?#20309;变形。

第二个重要的误差来源是,即氢原子不能被检测到,并且在大多数蛋白质晶体通常可达到的分辨率(1.5-3.0?)中原子类型不能被确定。这导致某些基团的?#38750;?#21462;向含糊不清,例如Asn和Gln残基的侧链酰胺或组氨酸侧链的咪唑环。

影响配体错误的因素:

同样,多个配体基团的?#38750;?#21462;向无法精确测定。对非标准基团,进行精确的几何约束是潜在的错误来源。例如,带有一个芳族取代基的叔胺的氮原子通常是平面?#27169;?#20294;它也可以是金字塔形的。 在高分辨率下(优于2.0?),可以根据电?#29992;?#24230;选择合?#23454;?#20960;何约束。 在较低的分辨率下,模型无法具有精确的几何形状。

柔性和?#38706;?#22240;子:

蛋白质是柔性分子,在晶体状态时,具有相当程度的柔性。在使用实验数据拟?#31995;?#21040;的模型中,原子在晶体中的移动性用?#38706;?#22240;子或B因子(B-factor)表示。上图给出了平均总位移与B因子之间的关系。 原子的B因子超过60?时,其平均位移往往大于1.5?,这是碳 -?#25216;?#30340;长度。这些原子通常在电?#29992;?#24230;图(如下图所示)中定义不明确,尽管在静态无序的情况下,并且电?#29992;?#24230;很弱,这些原子仍然可以很好地定义。在分析的过程中,应该记住,这些柔性表面残基应当要么被置于?#25105;?#30340;低能量构象中,要么从坐标文件中删除。不考虑这一点将会导致?#29616;?#30340;错误,尤其是在静电计算的过程中。

以位于人凝血酶表面的Lys87为例(如上图所示),暴露于溶剂的长链和柔?#22278;?#38142;(如精氨酸,?#34507;?#37240;,谷氨酸和谷氨酰胺)常常自由移动。这些侧链具有非常高的?#38706;?#22240;子,并且在电?#29992;?#24230;图中非常差或根本未定义。 应该考虑到许多这样的表面残基不具有明确定义的取向,这样的残基应该在文件中删除,或者置于?#25105;?#30340;低能构象中。

蛋白质晶体结构中的假阳性和假阴性:

毫不夸张的讲,蛋白质晶体学实验中?#35805;?#19981;会出现假阳性。 然而,就结合配体而言,对一些模糊的电?#29992;?#24230;特征的误解将导?#24405;?#38451;性的发生。这种错误的例子非常罕见。在基于片段的筛选(FBS)过程中,将不太明确的电?#29992;?#24230;斑点分配给混合物中存在的化合物,有时会造成极大的困扰。这个问题可能由于分辨率或X射线数据质量不足,多重叠结合模式的存在,或几个化合物或缓冲液组?#24535;?#20105;性结合到同一位点而导?#38534;?#37197;体识别和自动拟合程序是非常有用?#27169;?#20294;经验丰富的科学家对结果的仔细评估仍然至关重要。 在模棱两可的情况下,设置多个实验组。包括控?#35889;椋ú话?#25324;假定结合化合物的混合物),假定结合组(仅仅包括假定结合化合物)。

与假阳性相比,假阴性的出现在蛋白质晶体学中相?#20113;搗保?#29305;别是处理低亲和力化合物时。因此,在X射线实验中未能观察到结合不一定是化合物不能成为真正的配体。研究人员应使用质谱,表面等离子体共振和微量热法,以避免太多不确定的X射线实验。

原则上,在共结晶实验中,高浓度的蛋白质和配体非常有利于弱结合分子-蛋白复合物的研究。然而,晶体中的蛋白-蛋白接触可以阻止进入配体结合位点(在浸泡实验中)或挤出配体(在共结晶实验中)。 此外,复合物的形成可能受结晶条件(pH值,高盐或高浓度?#35270;停?#20302;分子量聚(乙二醇)或有机溶剂)的不利影响。 另外,在结晶条件下,某些化合物的溶解度可能非常低。

参考文献:Chapter 30 Protein Crystallography and Drug Discovery. In?The Practice of Medicinal Chemistry, 3rd Ed, 2008


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